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2022-12-29
转录组数据分析软件（分析转录组数据用什么软件）
本篇文章给大家谈谈转录组数据分析软件，以及分析转录组数据用什么软件对应的知识点，希望对各位有所帮助，不要忘了收藏本站喔。
今天给各位分享转录组数据分析软件的知识，其中也会对分析转录组数据用什么软件进行解释，如果能碰巧解决你现在面临的问题，别忘了关注本站，现在开始吧！
Seurat软件是一个R包，可以说是单细胞转录组测序分析的明星软件，很多单细胞测序文章都会引用该软件，引用次数也是杠杠的，而且也有详细的 在线教程 。本文也主要是根据其教程介绍一下使用Seurat软件分析一个样本的单细胞转录组数据的步骤及注意事项，供大家讨论。
导入分析需要的包
Seurat软件提供了很友好的函数可以直接读取10x Genomics的输出结果
导入文件后便可以创建Seurat对象
创建完Seurat对象后，Seurat将数据保存在不同的slot中，如filter_10x_object@raw.data, filter_10x_objectt@data, filter_10x_object@meta.data, filter_10x_object@ident，其中raw.data存放的是每个细胞中每个gene的原始UMI数据，data存放的是gene的表达量，meta.data存放的是每个细胞的统计数据如UMI数目，gene数目等，ident此时存放的是project信息。
由于技术原因，一个GEM中可能会包含2个或多个细胞，也可能不包含细胞，这时候可以通过观察每个barcode中的基因数目或UMI数目来判断。
上图展示的是每个barcode中的基因数目和UMI数目的关系，一般二者都成正相关关系，有个别barcode的基因数目和UMI数目过高，有可能就是包含2个细胞的GEM，可以考虑在后续分析中将其过滤掉。
我们不仅仅可以观察每个barcode的基因数目，还可以计算每个barcode中的线粒体基因含量等，从而更加仔细的观察数据的质量。
这张图片展示了每个barcode中基因数目、UMI数目以及线粒体基因含量的分布情况，根据上述2张图片就可以大致确定是否需要过滤哪些数据进行后续分析。
Seurat提供了一个很好用的数据过滤函数：
以上就是数据的预处理过程了，接下来就进入正式的分析阶段，包括数据的标准化、归一化、数据降维以及聚类分析等。
FindVariableGenes算法：首先计算基因的平均表达量，然后计算基因的离散度；接下来根据平均表达值将基因分成20块并计算每块的离散度的Z值。
如上图：横坐标代表基因的平均表达量，纵坐标代表基因的离散度的Z值，标有基因名的点就是由函数中的cutoff值决定的，改变cutoff值，这些标记也会随之改变。
数据的线性回归、中心化和比例化：对数据进行线性回归分析，去除不想要的变异源。
中心化：首先计算基因A在所有细胞中的平均表达量，然后分别将每个细胞中基因A的表达值减去平均值。
比例化：在中心化的基础上，首先计算基因A在所有细胞中的中心化值后的标准差，然后分别将每个细胞中基因A的中心化值除以标准差。这些步骤都在一个函数中完成。
单细胞转录组测序产生的数据是数万个基因在数万个细胞中的表达情况，属于典型的高维数据。如果把1个基因视为1个坐标轴的话，那么一个细胞的空间位置就是在数万个坐标轴中的定位，这样的话相同细胞类型的细胞就应该挨在一起，我们就可以根据细胞的空间位置判断细胞亚群了。可是我最多也就认识三维坐标啊，咋办，能不能把这些高维数据投影到二维坐标呢，那就交给PCA和t-SNE吧。PCA和tSNE都是数据降维分析方法，PCA属于线性降维，tSNE属于非线性降维。我们先执行PCA分析，使高维数据的信息最大程度保留在低维数据中，PCA分析利用的是保存在scale.data的值。
执行完PCA分析后，就要根据PCA得分来进行聚类分析了，但是在进行聚类分析之前，需要选择使用对少个主成分进行计算。每个主成分实际上代表的是相关基因集的信息，因此确定多少个主成分是一个重要的步骤，我们可以根据PCElbowPlot函数来判断。
从上图可以看到，拐点出现在10-15之间，我们可以选择15来进行聚类分析。Seurat采用的是基于图形的聚类方法，即利用PCA空间中的欧几里德距离构造一个KNN图（数学好的可以留下来帮忙讲讲）。
好了，到此我们就知道了我们的数据中有多少种细胞亚群了，怎么可以少得了图片展示呢。超棒的可视化方法tSNE要上场了。tSNE的目标是将在高维空间中具有相似局部邻域的细胞，在低维空间中放在一起。
既然我们知道了有多少种细胞亚群，那么是不是就要分析一下这些亚群间的差异性呢，交给FindAllMarkers吧。FindAllMarkers能够同时计算所有亚群的差异性（分别计算每个亚群与剩下的所有细胞的差异性）。
得到差异表达基因后，当然要进行展示了。
好了，剩下的就是进行生物学知识挖掘了，例如根据这些差异基因推断细胞类型啊之类的。
关于单个样本的单细胞转录组数据分析就介绍到这儿了，那多个样本的分析会有什么不同呢，我们下次再说吧。
TAC软件专为生物学家设计，使您能够：
执行阵列QC和数据规范化
对差异表达执行统计测试
专注于感兴趣的基因或通路
探索编码与非编码RNA之间的相互作用
解读复杂的选择性剪接事件
链接到公开可用的注释
获取序列信息以设计验证实验
本文目录一览：
单细胞转录组测序分析--初探Seurat
时代发展的步伐总是毫不留情的将你甩在身后，连车尾灯都看不见。当你还在沉迷于普通转录组数据挖掘时，已经有人悄悄的搞上单细胞了。单细胞转录组测序，顾名思义就是在单个细胞的分辨率基础上去研究细胞内的基因表达等，其主要目的是为了研究不同细胞类型的基因表达异质性，从而解决相关生物学问题。谈到单细胞就不得不提一下当下火爆的10x Genomics服务商了，具体参见 10x Genomics 。本篇文章暂时不介绍10x，主要介绍单细胞转录组数据分析软件Seurat。Seurat软件是一个R包，可以说是单细胞转录组测序分析的明星软件，很多单细胞测序文章都会引用该软件，引用次数也是杠杠的，而且也有详细的 在线教程 。本文也主要是根据其教程介绍一下使用Seurat软件分析一个样本的单细胞转录组数据的步骤及注意事项，供大家讨论。
导入分析需要的包
Seurat软件提供了很友好的函数可以直接读取10x Genomics的输出结果
导入文件后便可以创建Seurat对象
创建完Seurat对象后，Seurat将数据保存在不同的slot中，如filter_10x_object@raw.data, filter_10x_objectt@data, filter_10x_object@meta.data, filter_10x_object@ident，其中raw.data存放的是每个细胞中每个gene的原始UMI数据，data存放的是gene的表达量，meta.data存放的是每个细胞的统计数据如UMI数目，gene数目等，ident此时存放的是project信息。
由于技术原因，一个GEM中可能会包含2个或多个细胞，也可能不包含细胞，这时候可以通过观察每个barcode中的基因数目或UMI数目来判断。
上图展示的是每个barcode中的基因数目和UMI数目的关系，一般二者都成正相关关系，有个别barcode的基因数目和UMI数目过高，有可能就是包含2个细胞的GEM，可以考虑在后续分析中将其过滤掉。
我们不仅仅可以观察每个barcode的基因数目，还可以计算每个barcode中的线粒体基因含量等，从而更加仔细的观察数据的质量。
这张图片展示了每个barcode中基因数目、UMI数目以及线粒体基因含量的分布情况，根据上述2张图片就可以大致确定是否需要过滤哪些数据进行后续分析。
Seurat提供了一个很好用的数据过滤函数：
以上就是数据的预处理过程了，接下来就进入正式的分析阶段，包括数据的标准化、归一化、数据降维以及聚类分析等。
FindVariableGenes算法：首先计算基因的平均表达量，然后计算基因的离散度；接下来根据平均表达值将基因分成20块并计算每块的离散度的Z值。
如上图：横坐标代表基因的平均表达量，纵坐标代表基因的离散度的Z值，标有基因名的点就是由函数中的cutoff值决定的，改变cutoff值，这些标记也会随之改变。
数据的线性回归、中心化和比例化：对数据进行线性回归分析，去除不想要的变异源。
中心化：首先计算基因A在所有细胞中的平均表达量，然后分别将每个细胞中基因A的表达值减去平均值。
比例化：在中心化的基础上，首先计算基因A在所有细胞中的中心化值后的标准差，然后分别将每个细胞中基因A的中心化值除以标准差。这些步骤都在一个函数中完成。
单细胞转录组测序产生的数据是数万个基因在数万个细胞中的表达情况，属于典型的高维数据。如果把1个基因视为1个坐标轴的话，那么一个细胞的空间位置就是在数万个坐标轴中的定位，这样的话相同细胞类型的细胞就应该挨在一起，我们就可以根据细胞的空间位置判断细胞亚群了。可是我最多也就认识三维坐标啊，咋办，能不能把这些高维数据投影到二维坐标呢，那就交给PCA和t-SNE吧。PCA和tSNE都是数据降维分析方法，PCA属于线性降维，tSNE属于非线性降维。我们先执行PCA分析，使高维数据的信息最大程度保留在低维数据中，PCA分析利用的是保存在scale.data的值。
执行完PCA分析后，就要根据PCA得分来进行聚类分析了，但是在进行聚类分析之前，需要选择使用对少个主成分进行计算。每个主成分实际上代表的是相关基因集的信息，因此确定多少个主成分是一个重要的步骤，我们可以根据PCElbowPlot函数来判断。
从上图可以看到，拐点出现在10-15之间，我们可以选择15来进行聚类分析。Seurat采用的是基于图形的聚类方法，即利用PCA空间中的欧几里德距离构造一个KNN图（数学好的可以留下来帮忙讲讲）。
好了，到此我们就知道了我们的数据中有多少种细胞亚群了，怎么可以少得了图片展示呢。超棒的可视化方法tSNE要上场了。tSNE的目标是将在高维空间中具有相似局部邻域的细胞，在低维空间中放在一起。
既然我们知道了有多少种细胞亚群，那么是不是就要分析一下这些亚群间的差异性呢，交给FindAllMarkers吧。FindAllMarkers能够同时计算所有亚群的差异性（分别计算每个亚群与剩下的所有细胞的差异性）。
得到差异表达基因后，当然要进行展示了。
好了，剩下的就是进行生物学知识挖掘了，例如根据这些差异基因推断细胞类型啊之类的。
关于单个样本的单细胞转录组数据分析就介绍到这儿了，那多个样本的分析会有什么不同呢，我们下次再说吧。
TAC是什么软件?
无论是否掌握生物信息学资源，每位研究人员都可以轻松获得详细分析。 转录组分析控制台 (TAC) 软件现在包括 Expression Console (EC) 软件的功能，通过提供强大的交互式可视化显示，让您超越差异表达的简单鉴别。无论是否掌握生物信息学资源，每位研究人员都可以轻松获得详细分析。 转录组分析控制台 (TAC) 软件现在包括 Expression Console (EC) 软件的功能，通过提供强大的交互式可视化显示，让您超越差异表达的简单鉴别。TAC软件专为生物学家设计，使您能够：
执行阵列QC和数据规范化
对差异表达执行统计测试
专注于感兴趣的基因或通路
探索编码与非编码RNA之间的相互作用
解读复杂的选择性剪接事件
链接到公开可用的注释
获取序列信息以设计验证实验
RNA-seq分析软件“海底捞“--RNACocktail
" RNACocktail是一款集成软件，开发者调查了RNA-seq分析的所有主要步骤，评价了不同步骤下分析工具组合的准确性、效率和一致性，提出了一个综合的RNA-seq分析流程手册--”海底捞“----即在转录组的分析范围内，使用RNACocktail你可以组合不同的分析工具，从而一步完成流程分析。
RNACocktail本质上来说是一款”调度“软件，它可以调取你本地上所有的转录组分析工具，因此，这些分析工具需要你提前安装在本地，不建议使用conda安装RNACocktail，否则，在分析过程中你需要指定每一款转录组分析软件或者你所有的转录组分析软件都和RNACocktail一样安装在 同一个环境下。
在跑流程过程中，如果那一步”卡住“了，则可能是某一分析工具安装的问题：
软件版本和例子参见： RNACocktail (bioinform.github.io)
注意 ：RNACocktail需要使用者先建立转录组的索引，我这里就略过了
总的的来说，RANCocktail对于常规的的转录组分析流程提供了一个不错的一步到位的分析解决思路，但实际上，对于稍微复杂点的转录组数据，使用RNACocktail往往无法调整每一步分析的细节，而这又会对最终的结果造成较大的偏差。因此，从来就没有一步到位且能满足各种情况的完美软件，每一步都需要使用者去理解，调整参数，达到最优值。当然，这个软件的文章却能为我们对转录组分析软件提供新的理解和思考。
Gaining comprehensive biological insight into the transcriptome by performing a broad-spectrum RNA-seq analysis | Nature Communications
软件说明书 ： RNACocktail (bioinform.github.io)
中文说明 ： 2020-08-18 | 39个RNAseq分析工具与对比_穆易青的博客-CSDN博客
评估结果：
注：定量分为两大类：基因层次和转录本亚型层次，基因层次的定量使用GTF文件中的外显子和基因坐标信息，将reads比对信息与之对应，常用的软件有Featurecounts、HTSeq-count等
Stringtie参考： stringTie:转录本组装和定量工具 (qq.com)
总之，在RNA-seq分析过程中，需要考虑的问题是：分析目的是基因还是转录本？有参还是无参？是否需要比对？是否需要组装转录本？（featurecount）？比对到参考转录组还是参考基因组计数？
转录组定量工具-featureCounts安装及使用
计算表达量可以用 StringTie、Htseq-count或featureCount ，第一次做转录组分析时，参照了一篇Cell的子刊文章的分析方法，里面使用的STAR+featureCount，就直接用了这个软件，也就没再使用别的，回头看第一次使用时，发现好多细节没有注意到，温故而知新。featureCount是subread软件包里的一个命令，所以安装subread即可。而subread又有命令行版和R版，有服务器，自然选择命令行版了。
featureCounts ，有两个核心概念：
Feature: 指的是基因组区间的最小单位，比如exon;
Metafeature: 可以看做是许多的feature构成的区间，比如属于同一个gene的外显子的组合。
在定量的时候，支持对单个feature 定量(对外显子定量), 也支持对meta-feature进行定量(对基因进行定量)。当reads比对到2个或者以上的features 时，默认情况下，featureCounts在统计时会忽略到这部分reads, 如果你想要统计上这部分reads,可以添加-O 参数，此时一条reads 比对到多个feature，每个feature 定量时，都会加1。对于meta-features来说，如果比对到多个features 属于同一个 meta-features(比如一条reads比对到了exon, 但这些exon属于同一个gene), 则对于这个gene 而言，只会计数1次。 总之，不管对于 feature 还是 meta-feature, 只有比对多个不同的区间时，才会分别计数。
首先是官方网站
https://sourceforge.net/projects/subread/
http://subread.sourceforge.net
-a 指定注释文件
-o 指定结果输出目录及文件名
-p 能用在paired-end的情况中，会统计fragment而不统计read
-t 指定feature的类型，默认是exon，当然gtf里面还有gene、CDS或者直接以feature命名的分类方式。
其它参数：
-f 参数 该参数设置后统计的是 feature 层面（默认是 exon ）的参数，如果不设置则是直接统计 meta-feature 参数（即一个 gene 中的多个 exon ）
这时按exon分类进行统计，但是由于没有设置-f，在同一个gene内的exon会被统计成一个meta-feature，但是每个exon仍然会被显示出来，遇到一个gene有多个exon的时候看着就很乱。
第二种： 然后我加上-f，这样设置-t exon -f , 看一下结果：
我现在还不确定-f参数及-t参数对后面差异表达会不会有影响，初步判断不会的，但我注意到，-t gene -f设置后，count计数基于gene 层面，就不会出现相同基因的不同外显子count值，也就是第一列不会出现重复，并且可以直接得到基因信息，避免了注释、删除重复这个过程，我们做转录组测序，不就是想看基因水平的变化吗，我觉得这是很好的一个参数设置，不知道为什么网上一堆的帖子都没有这样设置，官网上示例也只是-t exon。希望未来有人和我讨论一下这个问题。
最终：我基于自己的理解，加上-t gene -f参数了。
1 、运行过程情况：
Successfully assignedalignments: 14212190 (32.7%), 说明只有32.7的paired reads 定量到了基因上，如果想知道那些没有分配上的reads是出于什么原因，则可看下图，输出中的summary文件。
Unmapped: 没有比对上；
MultiMapping:多个序列比对在有限的序列区域上，即参考组上有多个匹配点；
NoFeatures: 其比对与任何基因都不重叠；
ambiguous: 其比对与多个基因重叠。
2. 合并不同样本的 count 文件：
join count1.txt count2.txt count_12.txt
或者先提取出来每个样本的第一列和第七列信息，再通过join合并
cut -f 1,7 count1.txt | grep -v ‘^#’ count1_cut.txt
这样就能得到所有的样本的Count矩阵了。
总结：使用这个工具时要根据不同的项目，不同的目的，参数也要进行适当的调整，尤其是模式生物和非模式生物研究时，一定要想想参数设置合适不合适，我不认为写好了一个流程，就可以用来做所有课题的转录组分析了。这也是自己会和交给公司来做最大的好处了，自己的课题，只有自己才能对数据结果负责。
附：
STAR有一个参数-quantMode，可以指定--quantMode GeneCounts输出STAR计算出的reads计数结果，如果是比对完之后未做转录本拼装，直接对已知基因（构建基因组索引时GTF中囊括的基因）进行定量时，完全不需要再次用featureCounts或HTSeq再计算reads count。以后试试。
参考：
https://www.jianshu.com/p/9cc4e8657d62
http://doc.com/content/21/0714/12/76149697_986499746.shtml
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24227677/
http://subread.sourceforge.net/featureCounts.html
http://subread.sourceforge.net/RNAseqCaseStudy.html
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