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2022-12-28
荧光定量数据分析软件（实时荧光定量分析）
本篇文章给大家谈谈荧光定量数据分析软件，以及实时荧光定量分析对应的知识点，希望对各位有所帮助，不要忘了收藏本站喔。
今天给各位分享荧光定量数据分析软件的知识，其中也会对实时荧光定量分析进行解释，如果能碰巧解决你现在面临的问题，别忘了关注本站，现在开始吧！
该仪器采用集成Twister?机械臂的TaqMan?微流体芯片，可以轻松进行数百次实时定量PCR反应。QuantStudio? 7 Flex系统可助您最大限度提高自动化输出能力。
兼容各类应用
优化的实验方案和试剂与直观的软件相结合，兼容最广泛的应用。
获得值得信赖的结果
OptiFlexTM系统拥有六组分离的激发与发射滤片和21片滤片组合，能够确保最高的多重分析能力和化学反应灵活性，提高孔与孔之间、仪器与仪器之间的数据精确性。
1. 主要技术要求
1.1 *内置96孔模块，可升级96孔快速模块及384孔模块；
1.2 *开放5通道检测，连续波长检测，另外可以升级至6色激发光通道和6色检测光通道及21色荧光；
1.3 采用检测光滤光片分光，荧光通道开放，用户可自行添加荧光种类；
1.4 *冷CCD检测器96孔/384同步成像；
1.5 *最高升降温速率均可达到：6.5°C/秒；
1.6 *温控范围：4～99.9°C；
1.7 动力学线性范围：检测10个起始拷贝，101~109九个数量级，致信度99.7%。区分度要有装机试剂盒验证：能分辨1250、2500、5000、10000、20000拷贝数的初始模板标准品各4个重复验证线性准确度，36个重复的5000拷贝和36个重复的10000拷贝能以99.7%的置信度加以区；
1.8 *有防系统误差方法可供用户选择:内参比荧光Rox,校正加样误差和管间差异；
1.9 可分辨单位细胞起始拷贝数1~5拷贝之间的样本99.7%置信度；
1.10 *可分辨起始拷贝数200与300的样本（0.5倍差异）；可实现单拷贝起始模板的区分；
1.11 *高能量合金卤素灯激发,单个光源寿命不低于2000小时；
1.12 可升级HRM（高分辨率熔解曲线）分析系统，用于高通量筛选分析单核酸多态性位点（SNP）, 高分辨熔解曲线分辨率： 低至 0.04°C；
1.13 支持35分钟以内完成40循环的快速荧光定量PCR实验；
1.14 软件组成：
1.14.1 配备完备的定量PCR软件,等位基因分析软件。原厂的探针及引物设计软件，可用于PCR引物，巢式PCR，多重PCR引物，RT-PCR引物和Taqman探针的设计和自动测试；
1.14.2 可配备相对定量基因表达软件，可同时对无限个数据进行自动的分析、比对、作出柱状图，用于基因表达，药物疗效考核等相对定量分析；
1.14.3 配备完备的定量PCR软件,等位基因（SNP）分析软件和阴阳性结果自动判定软件；
1.15 试剂耗材开放；
1.15.1 可提供原厂人类、大鼠、小鼠、果蝇和拟南芥等多种模式生物全基因组范围表达试剂盒基因表达试剂盒（试剂盒包含:正/反向引物，TaqMan探针，）且同一PCR条件；
1.15.2 可提供原厂人类、大鼠、小鼠、果蝇和拟南芥等模式生物microRNA检测试剂盒（试剂盒包含:正/反向引物，TaqMan探针，）且同一PCR条件；
1.15.3 支持耗材：国际标准96孔 (0.2 mL) 反应板与光学盖膜，0.2 mL八连管，0.2mL单管；
1.16 内置触摸屏电脑：触摸屏电脑可备份还原超过100次的实验数据,可快速地设置多种应用；
*1.17 原装进口。
肌动蛋白基因（ACT）、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPD H）、18S rRNA、转录延伸因子基因（EF-1α）、多聚泛素酶基因（UBQ）、α微管蛋白基因（TUA）和β微管蛋白基因（TUB）等看家基因在之前的研究中常常被当作内参基因进行使用[5-8]。然而，越来越多的研究表明，在某种试验稳定表达的内参基因，在另一种试验中有可能是变化的[9-11]，而在任何试验条件下都能稳定表达的内参基因几乎不存在[12-13]。如果仅仅根据文献报道使用某个常用的内参基因，不仅可能导致试验结果的不准确性，甚至可能导致结论的错误。因此，本着严谨的科学态度，科研工作者首先必须从众多的内参基因中筛选出在各自试验条件下较为稳定的内参基因。
geNorm、NormFinder和BestKeeper是专门用于筛选内参基因稳定性的软件，但这3种软件的使用方法和分析的侧重点各不一样，为了让相关科研人员快速了解并掌握这3种软件的使用方法，笔者结合自身使用这些软件的经历，详细介绍了这3种软件的使用要点，以期为相关科研人员分析内参基因稳定性提供便利。
1geNorm软件
1.1软件概述
geNorm软件是Vandesompele等[14]在2002年编写的专门用于实时荧光定量PCR中筛选内参基因及确定最适内参基因数目的程序，该程序可以用于筛选任何试验的任意数目的内参基因，并最终挑选出2个或2个以上的内参基因组合来校正数据，可使相对定量的结果更为精确。geNorm 程序通过计算出每个内参基因稳定性的M值来筛选出稳定性较好的内参基因，判定标准为M值越小内参基因稳定性越好，反之，则稳定性越差。该软件还可计算引入1个新的内参基因后标准化因子的配对变异V值，并根据V n/V n+1值来确定所需最适内参基因的数目。默认的V值为0.15（该值可以人为稍作调整），如果V n/V n+1值<0.15，则最适内参基因的数量是n个；而如果V n/V n+1值0.15，则最适内参基因的数量是n+1个。
1.2操作流程
1.2.1修改Excel表格安全性级别。若geNorm软件打开后不能正常运行时，可能是由于Excel表格默认宏的安全性级别设置的比较高，这时需要将Excel表格安全性级别更改到最低级别。更改方法为点击Excel表格中的“工具”按钮，然后点击其下拉菜单“宏”的子菜单“安全性”选项，在弹出来的“安全性”对话框中将安全级别设置为最低。
1.2.2计算△Ct值。先找到该基因在所有样品中最小的Ct （Cycle threshold）值（表达量最高），再用其他样品的Ct值减
利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行内参基因稳定性
分析的方法
吴建阳1何冰1杜玉洁1李伟才2魏永赞2*
（1岭南师范学院基础教育学院，广东湛江524037；2农业部热带果树生物学重点实验室，中国热带农业科学院南亚热带作物研究所）摘要实时荧光定量PCR（RT-qPCR）由于具备灵敏度高、重复性好、特异性强及高通量等优点，已经成为研究基因表达分析的常用方
法，但其结果的准确性取决于内参基因。在任何试验条件下都能稳定表达的内参基因几乎不存在，科研工作者为了获得精准的试验结果，首先必须从众多的内参基因中筛选出稳定的内参基因。geNorm、NormFinder和BestKeeper等是专门用于筛选稳定性内参基因的软件，但这3种软件使用方法差异很大，为了让更多的科研人员了解这些软件、节省时间，笔者结合自己的科研经验详细介绍了这3种软件的使用方法，以期为相关科研人员利用这些软件筛选内参基因提供便利。
关键词内参基因；稳定性分析；geNorm；NormFinder；BestKeeper
中图分类号S60文献标识码A文章编号1007-5739（2017）05-0278-04
SYBR Green I 是一种结合于所有 dsDNA 双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的荧光染料， 可与所有的各种序列的双链 DNA 分子结合。 在 游离状态 下，SYBR Green I 发出 微弱的荧光 ，但 一旦与双链 DNA 结合 ， 嵌入至 dsDNA， 荧光大大增强 。
因此， SYBR Green I 的荧光信号强度与双链 DNA 的数量相关， PCR 扩增不同时期中， dsDNA 含量不同， SYBR Green I 荧光信号强度不同。 可以根据荧光信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量， 并可根据对照进行相关的计算和分析。
实验开始前，需准备好实验所需的各种试剂和耗材。
试剂包括：特异性 PCR 引物，新鲜提取备用的总 RNA。
使用的试剂盒有：用于合成 cDNA 第一链的罗氏试剂盒 Transcriptor FirstStrand cDNA Synthesis Kit，包含了 cDNA 反应所需要的所有实验组分以及相关的正对照反应组分。
配套 LightCycler® 480 使用的试剂盒 LightCycler® 480 SYBR Green I Master，包含了 PCR 所需的各种实验组分，如 1 号管中包含热启动 Taq DNA Polymerase及反应缓冲液， dNTP mix， SYBR Green I 染料和 MgCl2正式试验开始前，冰上解冻各个试剂及试剂盒组分，置于冰上待用。 注意：SYBR Green I Master 需避光放置。
所需仪器与耗材有：罗氏 LightCycler® 480 全自动实时定量 PCR 仪以及配套使用的 96 或 384 多孔板，透明封板膜等一次性耗材。赛默飞公司提供的 Thermo Scientific Arktik PCR 仪、单道移液器、 Nunc 冰盒及 QSP 盒装吸头等。
接下来进入实验部分，本实验操作流程是：首先用新鲜提取的 RNA 反转录合成 cDNA 第一链，然后进行实时荧光定量 PCR，其中包括： SYBR Green 反应体系的配置； PCR 程序设置； 运行 PCR 实验，样品编辑和结果分析。
首先是反转录合成 cDNA 第一链：
实验操作时注意：所有 RNA 相关的操作均要佩戴手套，防止 RNase 污染。相关操作严格按照试剂盒使用说明进行相关操作。
按照体系配方在冰上的 Rnase free 的灭菌 PCR 管中配置 Template primer mix，总体系 13μl，本实验是联合使用 anchored oligo dT 引物和随机六聚体引物进行的反转录。 先配置 NTC 对照，加入 9 号管水 10μl、 6 号管的 50mM oligo dT 引物 1μl、 5 号管的 0.6mM 随机六聚体引物 2μl，混匀。 然后进行样品一号管的体系配置， 依次加入 1μl 已调整浓度的总 RNA、 1μl oligo dT 引物、 2μl 随机六聚体引物、最后加 9μl 水补充至总体积 13μl，混匀。其他样品管，参照 1 号管的配置方法，依次加好反应体系。注意：可将总 RNA的模板量适当调整至 10ng-5μg，mRNA调整至 1-100ng。
若 RNA 样品浓度较低，则可加入 10μg/ml 的 MS2 RNA 来稳定模板 RNA。
将配好的反应 mix 在 PCR 仪中 65℃变性 10min，可有效减少 RNA 的二级结构。加热后迅速置于冰上骤冷，放置 5min。在反应 Template primer mix 中按体系配方顺序，依次加入以下试剂： 2 号管的 5×反转录酶 buffer， 4 号管 dNTP mix， 3 号管 40 U/μl 的 RNase 抑制剂， 1 号管 20 U/μl 的反转录酶，最终体积为 20μl。
若样品数较多，先配置反应 mix 再分装，小心吸打混合，切勿涡旋振荡。 混匀后于瞬时离心机上短暂离心，使样品和反应液落至离心管底部。将离心管放置 PCR 中，根据使用的引物以及目标 mRNA 的片段长度进行程序设置。本实验反应温度和时间设置为： 25℃， 10min， 55℃反应 30min。反应完毕后，于 85℃下加热 5min 灭活反转录酶， 再置于冰上停止反应。此反应产物可于 2-8℃存放 1-2h，或在-15 至-25℃下存放更长时间。
cDNA 产物无需进行纯化即可用于后续的 PCR 反应。 20μl 的 PCR 反应体系可取 2-5μl cDNA 反应产物进行扩增。此试剂盒中的反转录酶具有 RNase H 活性，可以在 cDNA 合成之后去除 RNA 模版，减少其对后续 PCR 的影响。
本部分实验，我们选用罗氏的 SYBR Green I Master 试剂盒进行基础的绝对定量分析。
本实验共设置 5 个标准样品，包含 1 个标记为 0 的空白对照， 5 个反转录样品，包含 NTC 对照，由于样品数较多，先配制不含模版的总体系，再分装为10管，加入各个样品的模板后，再将每个样品分装为 3 个复孔。
按照体系配方分别加入绿色盖子的 2×Master Mix， 10x Primer 上下游引物，PCR 级别水。 总体系配好后，在用移液枪轻柔吸打均匀，然后分装为 10 管，每管 55μl。往 10 管中分别加入各个样品对应的调整好浓度的 cDNA。STD 零加入 6μl 水代替模板，其余 STD 分别加入 6μl 已经逐级稀释好的标样模板。 反转录样品分别加入 6μl 浓度调整好的模板 DNA， 包含 NTC。混匀，然后将每个样按 20μl 每孔分装至 96 孔板中。用封孔膜盖好 96 孔板，将多孔板置于合适的离心机中 1500×g 配平离心 2min 将准备好的 96 孔板放置在LightCycler® 480 设备中。
双击打开 LightCycler® 480 的 1.5 软件并登陆，自动进入软件界面，点击 new experiment,在 Detection Format 选项中选择 SYBR Green I 模式, 点击 OK 完成检测通道的设定,接下来设置反应体积，对于 96 模块，反应体系为 10μl-100μl 之间，本实验是设定 20μl 的反应体系。
在 Program Name 中输入反应名称 pre incubation，预变性设定 1 个循环，无需进行荧光的收集，执行的温度和时间设定为 95℃ 10min，视图会根据设定进行实时的调整。
点击增加按钮，输入 Amplification，定义扩增循环的次数为 45 次，并选择荧光的收集功能 Quantification，然后设定 PCR 扩增循环的温度与时间为 95℃ 10s，点击增加按钮，设定退火温度和时间为 60℃ 10s，以上两步 Acquisition Mode 都默认选择 None，继续点击增加按钮，设置延伸温度和时间为 72℃ 20s，Acquisition Mode 选择 Single， Ramp Rate 均按自动调整值，无需再设置。
设置溶解曲线，在 Program 中的新的一行中输入 Melting Curves， 1 个循环数， Analysis Mode 选择 Melting Curves，时间和温度设置为 95℃ 5s， 点击增加按钮，新增设置温度和时间为 65℃ 1min，以上两步 Acquisition Mode 都默认选择 None。点击增加按钮，新增设置温度为 95℃，Acquisition Mode 选择 Continuous,其他设置无需改动。
设置保温的过程 Cooling，只需 1 个循环，无需收集荧光，设定温度和时间为 40℃、 1min。设置完成后点击右边的保存按钮保存设置的程序。此时整个 PCR的循环体系、温度的设置已经设定完毕。
点击 Start run 开始运行 PCR 反应，此时可在软件上实时监测样品扩增情况。
实验结束，点击 Sample Editor，进入样本编辑区。
Select Workflow 中选择 Abs Quant。根据样本在板中排布的方式进行样本编辑。设置阴性对照、空白对照、标准品以及未知样品等。
在 Select Sample 中，选中需要设置的样品孔。在下一栏中的 Sample Name 输入被选择样品组的名称，并在 Sample Type 中选择样品组的类型，最后点击 Make Replicates 设置复孔。标准品设置时，需填写拷贝数，只需填写好稀释倍数，初始浓度即可。 编辑好样品后，即可进行数据分析。如有需要，也可进行子集编辑。
样品编辑好后，可进行实验结果分析。
点击左边栏下方的 sum 按钮，相应出现实验的所有信息，包括：设计的反应程序，实验结果分析等。
点击 analysis，可以根据样品已有的数据进行细致准确地分析。
点击 Abs Quant second derivative max，弹出 create new analysis 窗口，在 Subset 选项中选择分析样品的分布区域，点击确定，即可出现分析图：相应样品的扩增曲线。
Standard Curve 是根据标准品得出的标准曲线，曲线左侧标有扩增效率、斜率、截距、线性关系、以及错误率。一般“Error”值越小，说明实验的准确率越高。
扩增效率如果越接近“2”，说明这次的扩增反应越好。
在数据表格，可显示单个样本的 Cp 值，以及相应的样本浓度值。
按复孔进行数据统计，显示 Cp 平均值，方差，浓度的平均值以及方差。 关于荧光定量数据分析软件和实时荧光定量分析的介绍到此就结束了，不知道你从中找到你需要的信息了吗 ？如果你还想了解更多这方面的信息，记得收藏关注本站。 荧光定量数据分析软件的介绍就聊到这里吧，感谢你花时间阅读本站内容，更多关于实时荧光定量分析、荧光定量数据分析软件的信息别忘了在本站进行查找喔。
本文目录一览：
- 1、如何利用RG3000和MX3000P两款荧光定量pcr仪进行相对定量数据分析
- 2、quantstudio3采集不到荧光信号
- 3、quantstudiotm 7 flex实时荧光定量pcr系统能够识别哪些荧光信号
- 4、最新最好用geNorm、normfinder、bestkeeper 内参基因软件使用方法
- 5、实时荧光定量 PCR
如何利用RG3000和MX3000P两款荧光定量pcr仪进行相对定量数据分析
（1）分页：将不同的引物（基因）分在不同的页；（2）将来自相同模板的名字一样，可以定义为1234...；例如： P1（引物）P2P3P4WT：calibratorActin(1)A(1)B(1)C(1)MT1：unknown1Actin(2)A(2)B(2)C(2)MT2：unknown2Actin(3)A(3)B(3)C(3) 说明：（1）P1：引物1，扩增相同的基因；（2）WT：calibrator 对照组样本，例如：野生型WT（Wild type）；（3）MT：unknown 未知组样本或处理组样本或待测组样本，例如突变型MT（Mutant type）。 数据分析时，选用Quantation 直接出原始图；选用2-△△Ct方法，然后根据提示选择：Analysis - Others - Delta Delta CT Relative Quatatition - validation performed、Gene Interest Quantitation 、Normalizer Quantitation 和Calibrator Defined 出相对定量柱状图；选择2 Standard Curves Relative Quantitation ，然后根据提示选择：Gene Interest StandardCurve、Normalizer Stard Curve和Calibrator Defined 出相对定量柱状图。 2、MX3000P荧光定量PCR仪：软件：MxPro根据样本来源和待扩增基因分类如下：Assoc.symbolSample：样本来源NormalizerGene of InterestGene of InterestAWT（Calibrator对照组）ActinGene1Gene2BMT1 (unknown1待测组)ActinGene1Gene2CMT2 (unknown2待测组)ActinGene1Gene2DMT3 (unknown3待测组)ActinGene1Gene2EMT4 (unknown4待测组)ActinGene1Gene2操作步骤：进入软件主页 --- 选择“comparative quantitation” --- well type 选择（Calibrator：如WT；Unknown：如MT）--- 选择：sybr / reference：rox --- 选择Normalizeing assay（看家/内参基因组） --- 然后将选择Assoc.symbol将相同样本来源的样品孔绑定起来；扩增程序设计；结果分析：选定Calibrator 和 Unknown组的内参基因和感兴趣基因，结果分析即可得到柱状图。quantstudio3采集不到荧光信号
系统bug。在使用quantstudio3系统人时，采集不到荧光信号是该系统bug导致的，只需要重新系统即可。QuantStudio3?是一款高性价比的实时荧光定量PCR系统，适合各种经验水平的用户。互动的触摸屏、简单易用的软件、预先优化的运行程序模板、以及基于网络浏览器的云服务平台（随时随地连接，分析，共享数据），QuantStudio3?为您提供极佳的体验和数据结果。
quantstudiotm 7 flex实时荧光定量pcr系统能够识别哪些荧光信号
更快地获得更丰富的结果该仪器采用集成Twister?机械臂的TaqMan?微流体芯片，可以轻松进行数百次实时定量PCR反应。QuantStudio? 7 Flex系统可助您最大限度提高自动化输出能力。
兼容各类应用
优化的实验方案和试剂与直观的软件相结合，兼容最广泛的应用。
获得值得信赖的结果
OptiFlexTM系统拥有六组分离的激发与发射滤片和21片滤片组合，能够确保最高的多重分析能力和化学反应灵活性，提高孔与孔之间、仪器与仪器之间的数据精确性。
1. 主要技术要求
1.1 *内置96孔模块，可升级96孔快速模块及384孔模块；
1.2 *开放5通道检测，连续波长检测，另外可以升级至6色激发光通道和6色检测光通道及21色荧光；
1.3 采用检测光滤光片分光，荧光通道开放，用户可自行添加荧光种类；
1.4 *冷CCD检测器96孔/384同步成像；
1.5 *最高升降温速率均可达到：6.5°C/秒；
1.6 *温控范围：4～99.9°C；
1.7 动力学线性范围：检测10个起始拷贝，101~109九个数量级，致信度99.7%。区分度要有装机试剂盒验证：能分辨1250、2500、5000、10000、20000拷贝数的初始模板标准品各4个重复验证线性准确度，36个重复的5000拷贝和36个重复的10000拷贝能以99.7%的置信度加以区；
1.8 *有防系统误差方法可供用户选择:内参比荧光Rox,校正加样误差和管间差异；
1.9 可分辨单位细胞起始拷贝数1~5拷贝之间的样本99.7%置信度；
1.10 *可分辨起始拷贝数200与300的样本（0.5倍差异）；可实现单拷贝起始模板的区分；
1.11 *高能量合金卤素灯激发,单个光源寿命不低于2000小时；
1.12 可升级HRM（高分辨率熔解曲线）分析系统，用于高通量筛选分析单核酸多态性位点（SNP）, 高分辨熔解曲线分辨率： 低至 0.04°C；
1.13 支持35分钟以内完成40循环的快速荧光定量PCR实验；
1.14 软件组成：
1.14.1 配备完备的定量PCR软件,等位基因分析软件。原厂的探针及引物设计软件，可用于PCR引物，巢式PCR，多重PCR引物，RT-PCR引物和Taqman探针的设计和自动测试；
1.14.2 可配备相对定量基因表达软件，可同时对无限个数据进行自动的分析、比对、作出柱状图，用于基因表达，药物疗效考核等相对定量分析；
1.14.3 配备完备的定量PCR软件,等位基因（SNP）分析软件和阴阳性结果自动判定软件；
1.15 试剂耗材开放；
1.15.1 可提供原厂人类、大鼠、小鼠、果蝇和拟南芥等多种模式生物全基因组范围表达试剂盒基因表达试剂盒（试剂盒包含:正/反向引物，TaqMan探针，）且同一PCR条件；
1.15.2 可提供原厂人类、大鼠、小鼠、果蝇和拟南芥等模式生物microRNA检测试剂盒（试剂盒包含:正/反向引物，TaqMan探针，）且同一PCR条件；
1.15.3 支持耗材：国际标准96孔 (0.2 mL) 反应板与光学盖膜，0.2 mL八连管，0.2mL单管；
1.16 内置触摸屏电脑：触摸屏电脑可备份还原超过100次的实验数据,可快速地设置多种应用；
*1.17 原装进口。
最新最好用geNorm、normfinder、bestkeeper 内参基因软件使用方法
实时荧光定量PCR（RT-qPCR）由于具备灵敏度高、重复性好、特异性强及高通量等优点，已经成为研究基因表达分析的常用方法[1-2]。实时荧光定量PCR分为绝对定量和相对定量，在进行相对定量分析时不需要已知量的标准品，因而该方法被经常运用，但该方法需要用内参基因对目的基因进行数据校正，才能获得精确的结果[3-4]。肌动蛋白基因（ACT）、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPD H）、18S rRNA、转录延伸因子基因（EF-1α）、多聚泛素酶基因（UBQ）、α微管蛋白基因（TUA）和β微管蛋白基因（TUB）等看家基因在之前的研究中常常被当作内参基因进行使用[5-8]。然而，越来越多的研究表明，在某种试验稳定表达的内参基因，在另一种试验中有可能是变化的[9-11]，而在任何试验条件下都能稳定表达的内参基因几乎不存在[12-13]。如果仅仅根据文献报道使用某个常用的内参基因，不仅可能导致试验结果的不准确性，甚至可能导致结论的错误。因此，本着严谨的科学态度，科研工作者首先必须从众多的内参基因中筛选出在各自试验条件下较为稳定的内参基因。
geNorm、NormFinder和BestKeeper是专门用于筛选内参基因稳定性的软件，但这3种软件的使用方法和分析的侧重点各不一样，为了让相关科研人员快速了解并掌握这3种软件的使用方法，笔者结合自身使用这些软件的经历，详细介绍了这3种软件的使用要点，以期为相关科研人员分析内参基因稳定性提供便利。
1geNorm软件
1.1软件概述
geNorm软件是Vandesompele等[14]在2002年编写的专门用于实时荧光定量PCR中筛选内参基因及确定最适内参基因数目的程序，该程序可以用于筛选任何试验的任意数目的内参基因，并最终挑选出2个或2个以上的内参基因组合来校正数据，可使相对定量的结果更为精确。geNorm 程序通过计算出每个内参基因稳定性的M值来筛选出稳定性较好的内参基因，判定标准为M值越小内参基因稳定性越好，反之，则稳定性越差。该软件还可计算引入1个新的内参基因后标准化因子的配对变异V值，并根据V n/V n+1值来确定所需最适内参基因的数目。默认的V值为0.15（该值可以人为稍作调整），如果V n/V n+1值<0.15，则最适内参基因的数量是n个；而如果V n/V n+1值0.15，则最适内参基因的数量是n+1个。
1.2操作流程
1.2.1修改Excel表格安全性级别。若geNorm软件打开后不能正常运行时，可能是由于Excel表格默认宏的安全性级别设置的比较高，这时需要将Excel表格安全性级别更改到最低级别。更改方法为点击Excel表格中的“工具”按钮，然后点击其下拉菜单“宏”的子菜单“安全性”选项，在弹出来的“安全性”对话框中将安全级别设置为最低。
1.2.2计算△Ct值。先找到该基因在所有样品中最小的Ct （Cycle threshold）值（表达量最高），再用其他样品的Ct值减
利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行内参基因稳定性
分析的方法
吴建阳1何冰1杜玉洁1李伟才2魏永赞2*
（1岭南师范学院基础教育学院，广东湛江524037；2农业部热带果树生物学重点实验室，中国热带农业科学院南亚热带作物研究所）摘要实时荧光定量PCR（RT-qPCR）由于具备灵敏度高、重复性好、特异性强及高通量等优点，已经成为研究基因表达分析的常用方
法，但其结果的准确性取决于内参基因。在任何试验条件下都能稳定表达的内参基因几乎不存在，科研工作者为了获得精准的试验结果，首先必须从众多的内参基因中筛选出稳定的内参基因。geNorm、NormFinder和BestKeeper等是专门用于筛选稳定性内参基因的软件，但这3种软件使用方法差异很大，为了让更多的科研人员了解这些软件、节省时间，笔者结合自己的科研经验详细介绍了这3种软件的使用方法，以期为相关科研人员利用这些软件筛选内参基因提供便利。
关键词内参基因；稳定性分析；geNorm；NormFinder；BestKeeper
中图分类号S60文献标识码A文章编号1007-5739（2017）05-0278-04
实时荧光定量 PCR
实时荧光定量 PCR ，简称 RT-QPCR, 属于 Q-PCR 的一种，目前该技术已得到广泛应用，如：扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、 SNP 分析等。荧光定量 PCR 常用的方法是 DNA 结合染料 SYBR GreenⅠ的非特异性方法。SYBR Green I 是一种结合于所有 dsDNA 双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的荧光染料， 可与所有的各种序列的双链 DNA 分子结合。 在 游离状态 下，SYBR Green I 发出 微弱的荧光 ，但 一旦与双链 DNA 结合 ， 嵌入至 dsDNA， 荧光大大增强 。
因此， SYBR Green I 的荧光信号强度与双链 DNA 的数量相关， PCR 扩增不同时期中， dsDNA 含量不同， SYBR Green I 荧光信号强度不同。 可以根据荧光信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量， 并可根据对照进行相关的计算和分析。
实验开始前，需准备好实验所需的各种试剂和耗材。
试剂包括：特异性 PCR 引物，新鲜提取备用的总 RNA。
使用的试剂盒有：用于合成 cDNA 第一链的罗氏试剂盒 Transcriptor FirstStrand cDNA Synthesis Kit，包含了 cDNA 反应所需要的所有实验组分以及相关的正对照反应组分。
配套 LightCycler® 480 使用的试剂盒 LightCycler® 480 SYBR Green I Master，包含了 PCR 所需的各种实验组分，如 1 号管中包含热启动 Taq DNA Polymerase及反应缓冲液， dNTP mix， SYBR Green I 染料和 MgCl2正式试验开始前，冰上解冻各个试剂及试剂盒组分，置于冰上待用。 注意：SYBR Green I Master 需避光放置。
所需仪器与耗材有：罗氏 LightCycler® 480 全自动实时定量 PCR 仪以及配套使用的 96 或 384 多孔板，透明封板膜等一次性耗材。赛默飞公司提供的 Thermo Scientific Arktik PCR 仪、单道移液器、 Nunc 冰盒及 QSP 盒装吸头等。
接下来进入实验部分，本实验操作流程是：首先用新鲜提取的 RNA 反转录合成 cDNA 第一链，然后进行实时荧光定量 PCR，其中包括： SYBR Green 反应体系的配置； PCR 程序设置； 运行 PCR 实验，样品编辑和结果分析。
首先是反转录合成 cDNA 第一链：
实验操作时注意：所有 RNA 相关的操作均要佩戴手套，防止 RNase 污染。相关操作严格按照试剂盒使用说明进行相关操作。
按照体系配方在冰上的 Rnase free 的灭菌 PCR 管中配置 Template primer mix，总体系 13μl，本实验是联合使用 anchored oligo dT 引物和随机六聚体引物进行的反转录。 先配置 NTC 对照，加入 9 号管水 10μl、 6 号管的 50mM oligo dT 引物 1μl、 5 号管的 0.6mM 随机六聚体引物 2μl，混匀。 然后进行样品一号管的体系配置， 依次加入 1μl 已调整浓度的总 RNA、 1μl oligo dT 引物、 2μl 随机六聚体引物、最后加 9μl 水补充至总体积 13μl，混匀。其他样品管，参照 1 号管的配置方法，依次加好反应体系。注意：可将总 RNA的模板量适当调整至 10ng-5μg，mRNA调整至 1-100ng。
若 RNA 样品浓度较低，则可加入 10μg/ml 的 MS2 RNA 来稳定模板 RNA。
将配好的反应 mix 在 PCR 仪中 65℃变性 10min，可有效减少 RNA 的二级结构。加热后迅速置于冰上骤冷，放置 5min。在反应 Template primer mix 中按体系配方顺序，依次加入以下试剂： 2 号管的 5×反转录酶 buffer， 4 号管 dNTP mix， 3 号管 40 U/μl 的 RNase 抑制剂， 1 号管 20 U/μl 的反转录酶，最终体积为 20μl。
若样品数较多，先配置反应 mix 再分装，小心吸打混合，切勿涡旋振荡。 混匀后于瞬时离心机上短暂离心，使样品和反应液落至离心管底部。将离心管放置 PCR 中，根据使用的引物以及目标 mRNA 的片段长度进行程序设置。本实验反应温度和时间设置为： 25℃， 10min， 55℃反应 30min。反应完毕后，于 85℃下加热 5min 灭活反转录酶， 再置于冰上停止反应。此反应产物可于 2-8℃存放 1-2h，或在-15 至-25℃下存放更长时间。
cDNA 产物无需进行纯化即可用于后续的 PCR 反应。 20μl 的 PCR 反应体系可取 2-5μl cDNA 反应产物进行扩增。此试剂盒中的反转录酶具有 RNase H 活性，可以在 cDNA 合成之后去除 RNA 模版，减少其对后续 PCR 的影响。
本部分实验，我们选用罗氏的 SYBR Green I Master 试剂盒进行基础的绝对定量分析。
本实验共设置 5 个标准样品，包含 1 个标记为 0 的空白对照， 5 个反转录样品，包含 NTC 对照，由于样品数较多，先配制不含模版的总体系，再分装为10管，加入各个样品的模板后，再将每个样品分装为 3 个复孔。
按照体系配方分别加入绿色盖子的 2×Master Mix， 10x Primer 上下游引物，PCR 级别水。 总体系配好后，在用移液枪轻柔吸打均匀，然后分装为 10 管，每管 55μl。往 10 管中分别加入各个样品对应的调整好浓度的 cDNA。STD 零加入 6μl 水代替模板，其余 STD 分别加入 6μl 已经逐级稀释好的标样模板。 反转录样品分别加入 6μl 浓度调整好的模板 DNA， 包含 NTC。混匀，然后将每个样按 20μl 每孔分装至 96 孔板中。用封孔膜盖好 96 孔板，将多孔板置于合适的离心机中 1500×g 配平离心 2min 将准备好的 96 孔板放置在LightCycler® 480 设备中。
双击打开 LightCycler® 480 的 1.5 软件并登陆，自动进入软件界面，点击 new experiment,在 Detection Format 选项中选择 SYBR Green I 模式, 点击 OK 完成检测通道的设定,接下来设置反应体积，对于 96 模块，反应体系为 10μl-100μl 之间，本实验是设定 20μl 的反应体系。
在 Program Name 中输入反应名称 pre incubation，预变性设定 1 个循环，无需进行荧光的收集，执行的温度和时间设定为 95℃ 10min，视图会根据设定进行实时的调整。
点击增加按钮，输入 Amplification，定义扩增循环的次数为 45 次，并选择荧光的收集功能 Quantification，然后设定 PCR 扩增循环的温度与时间为 95℃ 10s，点击增加按钮，设定退火温度和时间为 60℃ 10s，以上两步 Acquisition Mode 都默认选择 None，继续点击增加按钮，设置延伸温度和时间为 72℃ 20s，Acquisition Mode 选择 Single， Ramp Rate 均按自动调整值，无需再设置。
设置溶解曲线，在 Program 中的新的一行中输入 Melting Curves， 1 个循环数， Analysis Mode 选择 Melting Curves，时间和温度设置为 95℃ 5s， 点击增加按钮，新增设置温度和时间为 65℃ 1min，以上两步 Acquisition Mode 都默认选择 None。点击增加按钮，新增设置温度为 95℃，Acquisition Mode 选择 Continuous,其他设置无需改动。
设置保温的过程 Cooling，只需 1 个循环，无需收集荧光，设定温度和时间为 40℃、 1min。设置完成后点击右边的保存按钮保存设置的程序。此时整个 PCR的循环体系、温度的设置已经设定完毕。
点击 Start run 开始运行 PCR 反应，此时可在软件上实时监测样品扩增情况。
实验结束，点击 Sample Editor，进入样本编辑区。
Select Workflow 中选择 Abs Quant。根据样本在板中排布的方式进行样本编辑。设置阴性对照、空白对照、标准品以及未知样品等。
在 Select Sample 中，选中需要设置的样品孔。在下一栏中的 Sample Name 输入被选择样品组的名称，并在 Sample Type 中选择样品组的类型，最后点击 Make Replicates 设置复孔。标准品设置时，需填写拷贝数，只需填写好稀释倍数，初始浓度即可。 编辑好样品后，即可进行数据分析。如有需要，也可进行子集编辑。
样品编辑好后，可进行实验结果分析。
点击左边栏下方的 sum 按钮，相应出现实验的所有信息，包括：设计的反应程序，实验结果分析等。
点击 analysis，可以根据样品已有的数据进行细致准确地分析。
点击 Abs Quant second derivative max，弹出 create new analysis 窗口，在 Subset 选项中选择分析样品的分布区域，点击确定，即可出现分析图：相应样品的扩增曲线。
Standard Curve 是根据标准品得出的标准曲线，曲线左侧标有扩增效率、斜率、截距、线性关系、以及错误率。一般“Error”值越小，说明实验的准确率越高。
扩增效率如果越接近“2”，说明这次的扩增反应越好。
在数据表格，可显示单个样本的 Cp 值，以及相应的样本浓度值。
按复孔进行数据统计，显示 Cp 平均值，方差，浓度的平均值以及方差。 关于荧光定量数据分析软件和实时荧光定量分析的介绍到此就结束了，不知道你从中找到你需要的信息了吗 ？如果你还想了解更多这方面的信息，记得收藏关注本站。 荧光定量数据分析软件的介绍就聊到这里吧，感谢你花时间阅读本站内容，更多关于实时荧光定量分析、荧光定量数据分析软件的信息别忘了在本站进行查找喔。
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